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| 液体培养基其能有效地提高白芨种子萌发率 | |||
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白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]为兰科（Orchidaceae）白芨属（Bletilla Reichb.f.）多年生宿根草本植物，根呈白色，数个相连，故名白芨，别名白及、连及草、甘根。白芨花大色艳，具有较高的观赏价值；同时白芨生有肥厚的肉质块状假鳞茎，是重要的中药材之一，具有收敛止血、消肿生肌的功效。随着白芨的持续开发，市场需求连年增长，价格逐渐上涨，致使野生资源私挖滥采严重，导致白芨野生资源濒临枯竭，现有的白芨资源受到严重破坏，已无法满足市场需求，因而也被国家列为重点保护野生药用植物之一。
在自然野生状态下，成熟的白芨种子呈粉末状，非常细小，开花授粉15周后的种子有胚率仅为59%左右，很少萌发成苗，因此其种子自然萌发率极低，繁殖困难。目前人工繁育多采用分株繁殖，即将块茎切成小块种植，但繁殖系数低、消耗量大、大面积供种依然较为困难，难以满足大规模生产的需求。采取植物组织培养技术，可在短时间内获得大量的白芨实生苗，是一种快速有效的繁殖方法，目前主要通过将种子撒播在添加激素的固体培养基上萌发，再生出无菌苗，或诱导原球茎、经增殖生根后进行快繁，这要涉及4～5种以上的培养基，操作较为繁琐，且周期较长，最短在110 d内方能成苗移栽，相对生产成本较高。为此课题组探讨了一种基于液体培养基的白芨种苗离体快繁技术，
该技术选用液体培养基，用液体悬浮培养萌发种子，而不是常用的固体培养基表面萌发，其能有效地提高白芨种子萌发率，缩短白芨成苗时间，快速获得白芨幼苗，下面将该技术介绍如下。
1 未成熟白芨种子离体培养
1.1 种子表面灭菌及萌发
选取开花授粉15周后、未开裂的白芨蒴果（含种子），在成都农业科技職业学院园林园艺分院实验室超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s，去离子水冲洗1～2次。用解剖刀及镊子仔细剥开果实，将种子小心地抖落到无菌组织培养瓶中，加适量5%的次氯酸钠溶液（滴加1～2滴吐温-20）消毒20 min。用灭菌的50目细胞筛过滤种子；再用去离子水冲洗、过滤，反复4～6次，冲去表面残留的消毒液。将细胞筛上过滤的种子以MS+1.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内，于25 ℃、100 r/min黑暗培养15-20 d。通常培养5 d后，种子即可萌发，此时转入16 h/8 h的光周期环境下光照培养，一般接种15 d后种子发育形成叶片。
1.2 种子生长成芽
将接种15 d、已萌发的白芨种子经50目细胞筛滤去液体，把种子原球茎接种于MS+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的固体诱导成芽培养基上，尽量分散幼苗，每皿约100粒，于25 ℃、16 h/8 h光周期培养。一般培养30 d后，当幼芽生长为幼苗，约2 cm左右、根长约0.5 cm左右时即可进行生根培养。
1.3 生根培养
将平皿中的白芨幼苗接种到1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的固体生根培养基上，每瓶接种25～30株，于25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养，促进幼苗和根的生长，提高壮苗生根率。生根培养30 d后，组培苗生长为健壮的成苗，形态见图1。
1.4 炼苗移栽
当白芨幼苗的根生长到3～5 cm时（一般在白芨种子萌发后75-90 d）即可炼苗移栽，栽前先逐渐揭开瓶盖适应3-5 d外界环境，期间注意保持瓶内湿度。移栽时用清水洗净根部琼脂，避免损伤根及原球茎；将健壮的白芨组培苗移栽到装好育苗基质的穴盘中，选蔬菜或花卉育苗基质即可，栽后基质浇透水，于炼苗棚中培养。棚中前期注意弱光保湿，第一周应覆盖遮阳网保持弱光，并覆盖薄膜保湿；移栽15 d后白芨成苗即生长正常，移栽30 d左右即可定植，定植后常规田间管理，移栽情况见图2。白芨移栽存活的关键是原球茎的大小及活力，一般有原球茎的幼苗均能移栽存活，存活率可达95%以上。
2 近成熟白芨種子离体培养
2.1 种子表面灭菌及萌发
将开花后20周以上、近成熟的白芨蒴果（未开裂，含种子）用纱布包好，自来水流水冲洗30 min，再在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s，无菌水冲洗1～2次，用解剖刀及镊子小心剥开果实，将种子小心拨入无菌组培瓶中，加适量5%次氯酸钠溶液（滴加2～3滴吐温-20）消毒20 min。用灭菌的细胞筛（50目）过滤种子；再用去离子水冲洗、过滤，反复4～6次，冲去表面残留的消毒液。将细胞筛（50目）上过滤的种子，用MS+2.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内。25 ℃、100 r/min、黑暗培养15 d。
2.2 种子生长成芽
已萌发的种子经细胞筛（50目）滤去液体，将种子原球茎接种于MS+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的诱导成芽固体培养基上，尽量分散种子，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养20-30 d。
2.3 生根培养
将生成的幼苗及增殖的幼苗接种到1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的生根培养基里，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养30-40 d。
2.4 炼苗移栽
当白芨幼苗的根生长到3～5 cm长时，即可炼苗移栽，栽前先揭开瓶盖适应外界环境3-5 d。移栽时先用清水洗净根部琼脂，注意不要损伤根及原球茎结构；将健壮的白芨组培苗移栽到装有育苗基质的穴盘中，栽后浇透水，于炼苗棚中继续培养。管理上前期注意弱光保湿，第一周应加盖遮阳网保持弱光，并覆盖薄膜保湿；移栽15 d后白芨成苗即可生长正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常规田间管理。
3 成熟白芨种子离体培养
3.1 种子表面灭菌及萌发
将成熟的白芨蒴果（未开裂，含种子）用纱布包好，自来水流水冲洗30 min；在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s，无菌水冲洗1～2次，用解剖刀及镊子小心剥开果实，将种子小心拨入无菌组培瓶中，加适量5%次氯酸钠溶液（滴加2～3滴吐温-20）消毒20 min。将细胞筛（50目）上过滤的种子用MS+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内。25 ℃、100 r/min黑暗培养15 d，萌发率达99%。
3.2 种子生长成芽
已萌发的种子经细胞筛（50目）滤去液体，将种子原球茎接种于MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的诱导成芽固体培养基上，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养20-30 d。
3.3 生根培养
将长大的幼苗及增殖的幼苗接种到1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的生根培养基上，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养30-40 d。
3.4 炼苗移栽
当培养出的白芨幼苗根生长到3～5 cm长时，炼苗移栽，栽前先揭开瓶盖适应自然条件3-5 d。移栽先时用自来水洗净根部附着的琼脂，小心不要损伤根及原球茎结构；将健壮的白芨组培苗移栽到装有基质的育苗穴盘中，栽后浇透水，于炼苗棚中放置整齐，继续炼苗培养。管理上前期注意弱光保湿，第一周应加盖遮阳网保持弱光，并覆盖薄膜保湿；移栽15 d后白芨成苗即可生长正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常规田间管理。
4 小结
采用近成熟的白芨种子进行液体悬浮培养，能显著提高种子萌发率，可达99%，并加快原球茎的生成速度（15 d左右）。且该技术操作简便，成本低廉，每瓶液体培养基可萌发数万粒种子，且种子萌发整齐，出苗一致，污染率低，结合简化的固体培养基培养，大大缩短了白芨组织培养周期，最快能在75～90 d内获得大量健壮的无菌苗用于移栽，实现了白芨组培苗的高效快速生产，并有效简化了操作程序，降低了生产成本，便于规模化生产。
作者：熊丙全 廖相建 郑雪莲
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