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| 了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项 | |||
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一、目的要求
了解培养基的配制原理。
了解培养基常规配制程序。
二、基本原理
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础，由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相向。
三、实验材科
(一)药品
待配各种培养的组成成分，琼脂，1mol/L NaOH溶液，1mol/l (升，统一用大写)HCl溶液。
(二)仪器
天平或台秤，高压蒸汽灭菌锅。
(三)玻璃器皿
移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
(四)其他物品
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。
四、实验内容
(一)玻璃器皿的洗涤和包装
1．玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡。再用自来水及蒸馏水冲洗，洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2．灭菌前玻璃器皿的包装
(1)培养皿的包装 培养皿由一盖—底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
(2)移液管的包装 在移液管的上端塞入—小段棉花(勿用脱脂棉)。它的作用是避免外界及口中杂菌吹入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左有。棉花自身长度约1-1．5cm。塞棉花时，可用一外圈拉直的曲别针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45度角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌(见图5—1—1)。
(二)液体及固体培养基的配制过程
1．液体培养基配制
(1)称量一般可用1/100粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。
(2)溶化 将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶解。
(3)定容 待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。
(4)调pH 一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/l NaOH或1mol/l HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。
(5)过滤 用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。
2．固体培养基的配制
配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1．5％-2％)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。
(三) 培养基的分装
根据不同需要，可将己配好培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。
1．试管的分装
取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内(图5—1—2)。
装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150 mm时，液体培养基可分装至试管高度1／4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1／5(约3—4m1)；半固体培养基分装量为管高的1／3为宜。
2．锥形瓶的分装
用于振荡培养微生物用时，可在250 m1锥形瓶中加入50 ml的液体培养基，若用于制作平板培养基用时，可在250 m1锥形瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
(四)棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎
为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。
1．试管棉塞的制作
制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞(图5—1—3)。
制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2／3在试管内，1／3在试管外(图5—1—4)。
目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞。直接盖在试管口上。灭菌待用。
将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管拥成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。
2．锥形瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口，既保证良好通气，过滤除菌又操作简便，故极受欢迎。
在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。
(五)培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa灭菌20min（灭菌条件根据培养基不同有所差异，含糖培养基105℃，30min）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。
(六)斜面和平板的制作
1．斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面(图5—1—5)。斜面长度不超过试管长度1／2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
2．平板的制作
将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多，温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应采用无菌操作，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左于同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，月左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12m1的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿、使培养基均匀分布于整个平皿中、冷凝后即成平板(图5—1—6)。
(七)培养基的无菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1-2管（瓶），置于37℃恒温箱中培养1—2天，确定无菌后方可使用。
(八)无菌水的制备
在每个250 mL的锥形瓶内装99mL的蒸馏水并塞上棉塞。在每支试管内装4.5m1蒸馏水。塞上棉塞或盖上塑料试管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，100 Pa灭菌20分钟。
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