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| 在特定的培养基中细菌种类有其特征性的生长表现 | |||
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每一种微生物都有其特殊的生物学特性，细菌在适宜的生长条件下，在特定的培养基中有其特征性的生长表现，可作为鉴定细菌种类的依据。
[目的要求]
(1)了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的生长表现。
(2)了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
(3)掌握检查细菌运动力的几种方法。
(4)区别细菌的真正运动和受外力作用的摆动或移动。
[实验材料]
(1)葡萄球菌、炭疽杆菌、巴氏杆菌、猪丹毒杆菌的普通平板或鲜血(血清)平板、斜面、琼脂穿刺及明胶穿刺培养物。
(2)马链球菌马亚种、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、炭疽杆菌的肉汤培养物，厌氧梭菌的熟肉培养基培养物。
(3)大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌的半固体穿刺培养物。
(4)凹玻片、凡士林等。
[细菌在固体培养基上的生长表现]
1．琼脂平板上的生长表现细菌在固体培养基表面生长繁殖，可形成肉眼可见的菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上进行鉴别。例如，葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平、干燥、边缘不整齐的波纹状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。菌落的观察方法除肉眼外，可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。观察的主要内容有：
大小菌落的大小，规定用毫米(mm)表示，一般不足1mm者为露滴状菌落，1～2mm者为小菌落；2～4mm者为中等大菌落；4～6mm或更大者称为大菌落、巨大菌落。
形状菌落的外形有圆形、不正形、根足形、葡萄叶形。
边缘菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。
表面性状观察其表面平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷包蛋状，甚至有子菌落等(图6-1)。
隆起度表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者(图6—2)。
颜色及透明度菌落有无色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否光泽、透明、
透明及不透明。
硬度黏液状、膜状、干燥或湿润等。
溶血若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血，溶血情况怎样。
2．琼脂斜面上生长表现将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上(自底部向上划一直线)，培养后观察其生长表现，如图6—3所示各种生长方式。
3．琼脂柱穿刺培养中的生长表现将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其生长表现，如图6—4所示各种生长方式。
[细菌在明胶穿刺培养中的生长表现]
取大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌和其他多种细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况。细菌对明胶柱的液化作用，其形式如图6—5所示。
[细菌在液体培养基中的生长表现]
1．肉汤中生长表现将马链球菌马亚种、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，注意其混图6—5细菌明胶柱穿刺培养生长表现浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等(图6—6)。
细菌在肉汤中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、黏稠沉淀、絮状沉淀、小块状沉淀。另外还有不生成沉淀的菌种。
2．细菌在熟肉培养基中生长表现取各种厌氧梭菌分别接种于熟肉培养基中，培养后观察其生长表现，注意其混浊度、沉淀、碎肉的颜色和碎肉块被消化的情况。
[细菌运动力的检查]
1．显微镜直接检查法一部分细菌具有运动能力，可以独立运动；另一些细菌则没有运动的性能。在显微镜下观察，细菌的真正运动(自动运动)表现为能离开原来位置，不断改变方向的自由地游动。水的分子运动(布朗运动)也能见于细菌个体，使其在原地摆动，但不能远离原来位置移动。这种情况，都是外力作用的结果，不是细菌本身的真正运动。检查细菌的运动力，应用幼年培养物，最好刚从温箱中取出，并在温暖的环境下从速进行。
悬滴检查法
制片：取洁净的凹玻片一块，于其凹窝的四周整齐地涂以适量的凡士林。另取洁净盖玻片一块，用接种环于其中央滴上一小滴生理盐水或透明肉汤，再用接种环取待检固体培养物少量(不要过多)，混匀于液滴内；如为液体检材，可直接用接种环取一滴于盖玻片上，取起并翻转盖玻片，使液滴向下，以其对角线垂直于载玻片四边的位置，轻轻盖在凹玻片的凹窝上，略加轻压，使盖玻片四周与凡士林密着，封闭凹窝，即可进行镜检(或者将载玻片取起翻转，使凹窝对正盖玻片上液滴罩下，轻压，使与凡士林密着，封闭凹窝，并粘着盖玻片，然后再将玻片一起翻转，即可进行镜检)。
用凡士林封闭凹窝的主要目的，在于防止液滴干燥，可供较长时间观察；而使盖玻片如上述位置放置，则便于放上和取下，如用蜡笔划好分格，则可在一块盖玻片上作2～3个悬滴点(如只作短时间观察，亦可不用凡土林，而在凹窝四周以水湿润，甚至水也不用，光是盖上盖玻片即用)，如图（6-7）所示。
镜检：显微镜要放在平坦、稳固之处，不能倾斜或震动，放上悬滴标本片后，先用低倍镜找到液滴，移至视野中央，然后转换高倍镜和调整光线(宜稍暗)，对焦观察，一般不必使用油镜观察，必须用时，注意防止压坏盖玻片。
压滴检查法本法比较简便，宜于短时观察，也较适用于混浊或浓厚的液体检材(如血液、渗出液、脓汁、稀粪便等)。
制片：取一块洁净的普通载玻片，于其中央滴上一滴(可以稍大些)生理盐水，以接种环取少量固体检材混匀其中。如为液体检材，可以直接滴在载玻片上，然后取一个洁净的盖玻片，轻轻盖压在液滴上，要注意避免产生气泡。
镜检：同悬滴检查法。
暗视野检查法
制片：与压滴检查法同，但只能应用不超过1.5mm厚度的薄载玻片，否则暗视野集光器的斜射光交点，将不能调整至标本液滴中，而只能落在下面(载玻片内)，这就不能观察运动标本的影像。
镜检：暗视野镜检方法见实验一。
2．培养检查法
(1)半固体培养基穿刺培养法：以灭菌接种针蘸取纯培养检材，垂直刺进半固体培养基的琼脂柱中间直至管底，置37℃温箱中培养18～24h，四周扩散生长，使周围的培养基变成混浊；无运动力的细菌仅能沿穿刺线生长，周围的培养基仍然保持澄清(图6—8)。
(2)平板挖沟培养法：预先制备好鲜血琼脂平板，以无菌手术在平板中央挖去一条lcm宽的琼脂条，形成一条小沟，放置一条4cm×0.5cm的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使之与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，置37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至7天，如接种端的隔沟对边亦生长同样细菌，表示该菌有运动力。
[细菌大小的测定]
测量细菌的大小，以微米(μm)为单位，1μm = 1/1000mm。测量细菌大小的装置称为测微计，它由接目测微尺和接物测微计两部分组成。
1．接目测微尺为一个圆形玻片，其中央部刻有50～100个等分小格，小格的长度不定，随接目镜与接物镜的放大倍数不同而异。因此在测量细菌大小之前，须应用接物测微计来确定每一小格的长度。使用时将接目测微尺装入接目的镜筒内。
2．接物测微计为一载玻片，在玻片的中央，粘着一圆形小玻片，在其上刻有100个小格，每一小格的长度为10μm，所以全长为1mm(1 000μm)。
3．测量法先用低倍镜找到接物测微计的小格，然后换油镜使接目测微尺与接物测微计的小格重叠。借以求出接目测微尺中一个小格的绝对值。
例如接目测定微尺的7小格与接物测微计的一小格重叠时，则接目测微尺一小格的值为7：10：1：X，X=1.43，即一小格为1.43μm。
然后取下接物测微计，放在欲测大肠杆菌(Escherichia coli)染色标本。检查标本上的细菌的长、宽相当于接目测微计上的几小格，即为细菌体的大小。
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