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		真菌长期保藏过程中生理生化性状的影响

　　对于一些病原菌来说，真菌长期保藏过程中如何避免致病力的丧失成为最大的难题，真菌长期保藏过中，致病力下降的报道较多。Kelly 等发现Fusarium oxysporum f.sp. ciceris经过六年的在PDA培养基上大量的转接后在接种到鹰嘴豆上没有致病力[10]。一些保藏在蒸馏水中的Phytothphora 菌株经过长期保藏后也丧失了致病性[11]。Ryan 和 Ellison [12] 用原位结合超低温保藏的技术方法对Puccinia spegazzinii菌株进行了保藏处理，经过保藏后的菌株依然有产生担孢子的能力，但对寄主侵染能力下降，在叶柄的侵染没有成功。一些昆虫和植物的病原菌如果不经过回接到寄主昆虫或植物，也会逐渐丧失其致病性。Mota等[13]验证了Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株结合线虫的不同保藏工艺处理对捕食线虫能力的影响，发现添加保护剂可以提高Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株防治线虫的能力。López Lastra等[14]对一些Hyphomycetes Entomophthorales Trichomycetes和 Oomycetes的9株内生病原真菌进行了18个月的长期保藏的试验，并在第3、6、12、18个月分别监测保藏菌株的活性及其侵染性，Paecilomyces fumosoroseus菌株蒸馏水、矿油、-20℃和-80℃保藏等几种保藏方法都适合，Smittium culisetae 和 Leptolegnia chapmanii 菌株只适合于蒸馏水和矿油保藏。Tommerup用冻干法保藏VA真菌，并监测了其孢子萌发能力、菌丝生长能力以及定殖能力[15]。对于一些菌株的致病性等能力的丧失，可以用一些酶活和代谢产物的指标进行监测[16]。Shinohara 等[17]发现，用于酿酒的Saccharomyces cerevisiae 菌株经过多次的斜面转接后，引起了酒品质的变化。

　　真菌次级代谢产物一直是真菌学研究利用的重点，真菌可以产生一系列的次级代谢产物[18]，并且一些典型的代谢产物可以用于真菌类群的划分[19]。Svendsen 和 Frisvad报道次级代谢产物chemosystematics应用聚类分析分析279株青霉真菌到种的水平上[20]。对于真菌次级代谢产物的生产菌株来说，产生代谢产物功能的稳定性保藏及其重要，但是真菌在保藏及其生产等过程中可能丧失产生某一种代谢产物的能力。Svendsen 和 Frisvad发现两株Penicillium comembertii 丧失了产橘霉素的能力（citrinin）[20]，这两株菌Bridge 等报道能够产生橘霉素[21]。真菌菌株发生退化可能是真菌产生次级代谢产物的情况发生了改变[22]、[23]。Ryan在对Metarhizium anisopliade 和 Fusarium oxysporum 菌株进行保藏处理后发现次级代谢的产生情况发生了改变[20]，菌株产生次级代谢产物的能力对保藏过程极为敏感，多数的保藏物与保藏前的次级代谢产物情况发生了改变，产生次级代谢产物的稳定性随着保藏时间的延长而降低。经过两年的保藏，斜面转接保藏方法保藏的菌株M. anisopliade 和 F. oxysporum都丧失了产生胞外次级代谢物的特点，而用其它保藏方法的一部分菌株产生某些次级代谢产物的特点得以保存。在Ryan[16]研究中还发现，真菌的保藏方法对于菌株的次级代谢产物稳定性保藏局限于“株”的水平上，对于同一种的不同菌株来说，同一保藏方法处理，得到的保藏结果可能就不一样。真菌的次级代谢产物可以应用于分类学、教学研究以及应用于工业生产中，长期保藏过程中菌株次级代谢产物产生情况发生改变，带来的后果将是十分严重。

　　真菌有产生多种胞外酶利用多种类型底物的能力，真菌酶作用机理、酶制剂的研究开发历来受到重视，一些诱导酶，如脂肪酶、几丁质酶、蛋白酶等具有降解复杂大分子结构物质的能力，在昆虫、植物病害的生物防治中具有重要作用。活力真菌长期保藏对酶活力变化的影响长期存在。一些商业开发的检测板，如APTZYM、API50CH以及Biolog检测板可以用于分析真菌胞外酶活的变化情况[16] [24] [25] [26]。Ryan在研究M. anisopliade 和 F.oxysporum发现，其胞外酶的分泌能力在长期保藏过程中发生改变，而酶活力是菌株生理稳定性重要指标，不同保藏方法对酶活力的稳定性同样体现在“株”的水平上，而不是“种”的水平[16]。Ryan在F. oxysporum菌株两年的保藏试验中发现，大多数的分离物丧失了α-甘露糖苷酶或β-木聚糖酶活性，壳二糖酶、葡聚糖酶和阿拉伯糖酶活性偶尔丧失[16]。M. anisopliade在两年的低温保藏试验中，丧失了β-galacosidase α-fucosidase β-chitobiosidase β-glucuronidase的活性。M. anisopliadeM1菌株的leucine arylamidasde的活性在所有经过蒸馏水保藏的分离物中能够检测到，而在冻干和低温保藏的分离物中部分能够检测到leucine arylamidasde的酶活。而对于tryspin的酶活检测，在-20℃的低温保藏处理和蒸馏水的保藏tryspin的酶活力情况保藏最好。

　　分子生物学在近20年的时间里发展较快，基于PCR技术使真菌长期保藏后的基因信息完整性检测成为可能，如果真菌在保藏过程中基因信息发生缺失的话，那就有可能真菌的一些有价值的生理性状、产酶能力遭到破坏。对于模式菌保藏过程中基因信息的缺失，在分子信息的分类研究中，完全有可能影响分类学的研究结果。Kumata等[27]注意到来自不同菌种保藏中心的同一个Trichoderma菌株，在PCR分子指纹分析中，得出了相偏离的结果。Kelly 等在对保藏了12年的F. oxysporum f.sp. ciceris菌株的一个分离物与其它分离物相比，没有显现出应有的典型分子特征[10]。Horgen结合RFLP与染色体分析，研究了Agaricus bisporus 菌株染色体丢失、退化情况[28]。Shinohara 等发现Saccharomyces cerevisiae 在450天内经过150次的转接，菌株的染色体核型发生了微小的变化[17]。F. oxysporum f.sp.niveeum 菌株在连续转接培养中发现DNA的甲基化现象[7]。斜面转接、油管等保藏方法的机理是降低菌株的代谢速率，而冻干、超低温保藏的机理是停止细胞代谢，目前对细胞代谢停止、恢复代谢后真菌基因信息、染色体信息是否完整的研究报道较少。

　　避免真菌菌株在保藏过程中形态特征、生理生化性状、基因信息的发生变化对于菌株的工业化生产、分类、教学研究具有重要意义。虽然真菌菌株在长期保藏中不可避免的出现致病力下降、酶活力下降、酶活性丢失，但从Ryan 等人的研究中可以发现，采用不同的保藏程序方法可以不同程度的降低菌株长期保藏过程中退化。此外，菌株在致病活性、酶活力性状的长期保藏对保藏工艺选择性体现在“株”的水平上，同一个种菌种的不同菌株也需要进行保藏工艺的研究才能保证其形态特征、生理生化特征的稳定遗传。对于一些真菌菌株诱导酶活性的丢失，一般情况下只要真菌菌株基因信息完整，在加入相应诱导物，真菌菌株会可能重新恢复一定的产酶能力，但酶活力的产量是否得到恢复视具体情况而定。对于一些生产性的真菌菌株或工程菌株来说，多是经过诱变、基因重组、基因突变或转基因等手段得到，其基因组的稳定性相对于野生菌株来说，稳定性可能下降，此类菌株在长期保藏的过程中需要特殊的保藏工艺处理，才能够保证基因信息的稳定遗传。

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