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| 10种常用的微生物菌种保藏方法你知道几种？ | |||
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临床微生物实验室经常能够分离到一些有意义的菌种，但接种在平板上的细菌放4℃冰箱只能保存数天，并且细菌在培养基上移种3次后，其形态、菌落、毒力等均易发生变异，监测日常工作的室内质控用标准菌株也需要长期留存。所以尽可能长期有效地留存菌种对于系统地分析当前流行株的生物学、分子生物学特征及耐药性变迁，医院感染病原学调查、新药临床研究都十分重要的意义。
本文介绍几种常用的菌种保存方法，如下：
一、常规保存法
该法操作简单，只需普通冰箱保存，每个临床微生物实验室均可采用。但缺点是留存时间短，传代频繁，菌种易变异。
二、半固体穿刺保存法
用穿刺接种法将细菌培养物接种于半固体培养基内，经 37℃18-24h培养后，加一层无菌的液体石蜡，厚度约为 1cm，置冰箱保存。肠道杆菌及葡萄球菌等，一般可保存3-6个月。当需传代移种时，将半固体菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再取菌移种于新的培养基。将沾有少量液体石蜡的接种环浸于 95％酒精中片刻，再烧灼灭菌以免直接在酒精灯上烧灼时，液体石蜡四处溅散而引起污染。如保存副溶血性弧菌可加入NaCl制成3.5%高盐半固体，在室温下可保存 1个月。
三、斜面保存法
⑴普通琼脂斜面保存法：葡萄球菌、肠道杆菌等对营养要求不高的一股细菌可接种于普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏液，以防干涸 (但变形杆菌"OX"及伤寒杆"O"菌株宜接种于干燥的琼脂斜面以防变异)。用橡皮塞塞紧，经37℃18-24h培养后，存放于 4℃冰箱中，一般可保存3-6个月。
⑵血液琼脂斜面保存法：链球菌及肺炎球菌等对营养要求较高的细菌应接种于血液琼脂斜面上，37℃培养生长后，放4℃冰箱保存。链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎球菌则须 4d移种一次。
⑶鸡蛋斜面保存法：将细菌接种于鸡蛋斜面上，经 37℃18-24h培养后，加无菌液体石蜡至斜面浸液，再超出约1cm，置4℃冰箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙门氏菌及其它含表面抗原的细菌，可保存3-6个月。
⑷吕氏血清斜面：白喉棒状杆菌可保存在该培养基上，其成份为 1 %葡萄糖肉汤 (pH7.4) 1份，无菌牛血清或兔血清3份。白喉棒状杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛，菌体形态典型，如在培养基中再加入5%-10%的中性甘油，则培养出的白喉棒状杆菌异染颗粒更为明显，单24小时后即衰老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体粗大3-4倍，置4℃可保存2周至1个月。
四、砂土管保存法
适用于产芽孢的细菌
将过筛后的中性细砂烘干，装入小试管内约lcm高，塞以棉塞，灭菌烘干备用。用无菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物，制成菌悬液。然后吸此菌悬液约0.5ml注入砂土管内，以砂土全部浸湿为度。塞好棉塞，放入干燥器内抽干。然后放在装有氯化钙(吸水剂)的干燥瓶内，置冰箱保存备用。需用时可取一接种环砂土接种于适宜培养基上培养即可。
五、低温冷冻保存法
实验室必须配备-20℃以下低温冰箱，冰箱温度越低，保存的时间越长。
六、滤纸片低温冷冻保存菌种方法
将新华滤纸片剪成3mm×3mm，经高压蒸汽灭菌置无菌器皿中备用，0.5ml无菌带盖塑料离心管。将待保存菌种在血平板上分离纯化后，用无菌小镊子夹住滤纸片，在平板上刮取多量细菌，放在塑料离心管内，1只离心管中可放数十片带菌滤纸片，然后盖上盖子，用胶布将盖口封严，注明患者姓名，菌名及保存日期等以备查找。将塑料管放在-70℃冰箱内保存。使用时将菌种分别从塑料离心管中取出1片，放入增菌肉汤中,35℃孵育18～24ｈ，再将菌悬液移种于血平板上。本方法适于保存对营养要求不高的细菌，而不适于苛养菌的保存。
七、湿牛奶冷冻法
材料 ①保护剂牛奶的准备：新鲜牛奶经脱脂棉反复 3次过滤后，10磅10min高压蒸气灭菌后，冰箱保存备用。②菌种管的处理：先经清洁液浸泡1天，之后用清水冲洗，再用蒸馏水浸泡过夜，以达中性，然后管口塞上棉花，经15磅30min高压蒸气灭菌备用。
方法 将各种细菌种于各自生长良好的平板培养基上，经分纯后在37℃孵箱孵育18h后，用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，然后用无菌毛细滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部，每管球部约有一半的菌液，之后火焰封口，保存于-20℃冰箱。抵抗强的细菌至少可保存3年，抵抗力弱的细菌保存不低2年。
八、细菌鉴定卡保存菌种
本法适用于使用VITEK全自动微生鉴定仪的实验室。方法是将鉴定卡标注后直接放置-20℃冰箱保存，复苏时将鉴定卡直接从-20℃移至35℃，待小孔液体完全融化后，以无菌手续，用注射器抽吸出阳性生长孔内的液体，点种于合适平板，置35℃孵箱内24～48小时即可。该法生化卡内的细菌反复冻融 5次，分离出的细菌效果相同。葡萄球菌属、肠杆菌属、念珠菌属存活时间不小于29个月；肠球菌属、黄杆菌属、不动杆菌属存活时间不小于21个月,链球菌属和假单胞菌属存活时间不小于10个月。
九、商品化菌种保存管
每只保藏管中含20-25个小珠以及缓冲液，使用时将菌落挑入缓冲液中，混匀，将缓冲液吸去，置-70℃冰箱保存可达10年，-20℃冰箱可保存1-3年。复苏时，只需将小珠接入肉汤或平板上滚动即可。商品化菌种保存管操作简单，但价格偏高。笔者预计随着经济的不断发展和实验室条件的改善，使用的单位将会越来越多。
十、冷冻真空干燥保存法
该法是目前保存菌种的最佳方法，具有如下几个突出的优点：①适用范围广。除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此方法保藏外，其他各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及病毒均可采用此方法保藏；②保藏期长，成活率高。有人报道保藏在真空冷冻干燥安培管中的真菌成活期长达40多年，一般微生物至少可保存10余年；③微生物在保藏期内可避免其它杂菌污染；④便于携带运输，易实现商品化生产。其缺点为需要一定的设备（冷冻真空干燥机）、操作繁琐等。菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。③将加好菌液的离心管盒置-20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封离心管口。放-20℃冰箱保存。
临床微生物实验室可以根据本室的条件，挑选最适合的菌种保存法，也可以加以改良，其原则是除了菌种存活外，还必须保证其生物学性状不发生改变。
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