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| ips技术在研究中存在的技术问题及优化方法 | |||
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诱导多能干细胞(iPS)是通过导入特定的转录因子使成体细胞直接重编程为胚胎干细胞(ESCs)样的多能性干细胞(Takahashi and Yamanaka，2006)。
1.1 最初获得iPS技术路线
2006年，日本Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个基因中筛选出能使成体细胞转变成干细胞的基因，通过研究最终确定了Oct4、Sox2、c—Myc和Klf4 4个转录因子基因；通过逆转录病毒将上述4个转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞中；在胚胎干细胞培养条件下，以Fbxl5为标记物进行筛选，获得了Fbxl5+的干细胞。新获得的这种细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物等方面与胚胎干细胞非常相似，将这些克隆状细胞放在饲养层上进行培养，每个细胞都显示出与胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)相似的形态。经鉴定，这些iPS无论在形态学上还是在分子水平上，其特性均与ESCs高度相似。在疾病治疗中的用途 Hanna等将小鼠皮肤的成纤维细胞重编程为诱导性多潜能干细胞，再定向诱导其分化为造血干细胞， 移植后用于治疗人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，取得显著的治疗效果，具体应用如图1。
图1 利用Ips治疗镰刀状红细胞贫血病模型
1.2 iPS诱导形成的机制
在体细胞重编程过程中，体细胞特异表达的标记基因(如成纤维细胞的Thy1)首先被抑制；随后多潜能性细胞的一些特异表型出现，如碱性磷酸化酶和SSEAl的表达；在iPs细胞形成的晚期，才激活内源性的Oct4、Sox2和Nanog等多潜能性细胞特异的转录因子；在重编程晚期还可检测到X染色体的激活、端粒酶活性的增加和端粒长度的延长。这些基因的激活与抑制都伴随着组蛋白表观遗传修饰和染色质结构的变化。C—Myc在重编程早期抑制体细胞特异表达的标记基因中起重要作用，其他3个因子Oct4、Sox2和Klf4则在激活多潜能性细胞的标记基因中起作用。如果未能有效地激活多潜能性标记基因(特别是晚期激活的多潜能性基因)和改变它们的表观遗传修饰，细胞就处于部分重编程的状态。
1.3 iPS研究的意义
iPS 细胞同样具有自我更新和分化的全能性,其功能与胚胎干细胞类似,无需制造胚胎, 从任何组织的细胞都可以制造出具有干细胞功能的细胞, 避免了转基因面临的伦理问题, 更重要的是简化了制备转基因动物的过程。iPS 产生机理与相关技术的深入研究,将会给治疗人类疑难疾病、组织修复与再生以及生物制药等诸多生物医学领域带来新的发展机遇。源自患者的诱导多能干细胞，进一步用于自体移植可避免免疫排斥问题，目前故iPS细胞的诞生被誉为生命科学领域新的里程碑。
1.4 iPS研究成果
自1962年，Gurdon将某些特定的成体细胞如青蛙的皮肤细胞，经过适当的移植实验，产生新的蝌蚪以来，Ips技术的研究有了突飞猛进的发展。如2012年10月8日，英国研究员John B.Gurdon和日本科学家Shinya Yamanaka，因为在Ips的成体细胞重编程成为干细胞的研究中做出了巨大贡献，共同获得2012年的诺贝尔生理学或医学奖。2013年6月，美国Smith对诱导多能干细胞进行分化，在试管内制造出了无数的人类红血细胞和血小板。2013年7月，美国Samuel等使用人体诱导多能干细胞制造出能在实验鼠体内存活280d的人造血管。其他发展历程中的重大事件.
2 . iPS的发展进程
2.1iPS相关因子的功能
Oct 4( Octamer- binding Transcription Factor4,八聚体转录因子4 ) 基因是P O U转录因子家族成员之一，是参与调控胚胎干细胞自我更新、维持其全能性、细胞增殖的最重要的转录因子之一，是参与诱导多能干细胞重编码过程最为重要的因子。Oct4是维持ESC全能性和自我更新的关键基因，在未受精的受精卵卵母细胞中即可表达。当敲除Oct 4或Oct 4发生突变时，胚胎不能形成内细胞团，拟胚体发生凋亡，胚胎干细胞丧失全能性。Oct 4与Nanog、Sox2形成网络调节通路，调控胚干细胞的全能性。这3种基因对大量基因通过前馈系统、自身调节网络与其他信号转导通路调控来维持胚胎干细胞维持全能性及抑制分化。
Sox2基因是SRY(性别决定基因)超家族相关的转录因子Sox家族成员，在动物界广泛存在。Sox2基因是细胞重编程的重要基因之一，参与细胞的形成，维持胚胎干细胞全能性和自我更新，决定动物性别与分化、神经系统发育、眼的发育等过程。作为Oct4基因的协同基因，Sox2在胚胎形成过程中，Oct4和Sox2含量会逐渐降低，Sox2突变可能引起Oct4基因突变，进而引发干细胞丧失全能性。
Nanog是NK家族基因，参与维持胚胎干细胞全能性，与生殖细胞肿瘤生成的关系密切，参与人成纤维细胞重编程为iPS过程。Nanog突变体会导致拟胚体的形成缺陷，缺失不会影响干细胞自我更新能力和形成胚胎嵌合体的能力，但会促进Es细胞多向分化，使胚胎内胚层自发分化为内脏、体壁和腔室，而其他胚层细胞凋亡。因此，Nanog在胚胎干细胞中的作用相当于一个开关，调节ES细胞自我更新和多向分化。
Klf4是Klf蛋白家族的成员之一，具有多串联型锌指结构，参与调控细胞的增殖、分化。与Oct4、Sox2和c—Myc共同调控干细胞自我更新和维持全能性，参与人和小鼠体细胞重编程为iPS过程。敲除或低表达Klf4基因不会导致胚胎凋亡，不会影响其自我更新和胚胎发育但会导致遗传疾病。
c—Myc基因是细胞癌基因的重要成员，参与细胞生殖、分化调节过程，在小鼠体细胞重编码为iPS过程中起重要作用，调节造血干细胞的自我更新和分化。Nakagawafz等研究发现，在小鼠体细胞重编程过程中c—Myc可敲除，并提高重编程率、降低肿瘤发生。
2.2 iPS研究中存在的技术问题及优化方法
实验证明．iPS细胞功能几乎和ESC一样，表达ESC的各种表面标记．可分化为各种组织细胞。但还有很多问题有待解决。（1）c—Myc和Klf4属于致癌因子．用病毒作为载体．可能使致癌因子整合到受体基因组内．引发基因突变产生高致癌性的iPS细胞。（2）iPS细胞产生的效率较低，重组率只有0．1％左右。究其原因可能是0ct-4在胃或肠内的表达阻止了原始细胞的分化或者其他在维持多能性中起重要作用的多聚蛋白以及染色体组的修饰因子ISW I和Brgl被插入的逆转录病毒激活。（3）安全性问题，诱导生成多功能干细胞的方法大多都涉及到病毒基因及反转录病毒载体的使用，这有可能使所诱导的细胞发生异常。（4）由于急性免疫排斥反应的存在，来源于多能干细胞的组织在移植后的存活率很低。
解决成瘤性问题、表观遗传学问题、移植排斥问题及提高效率，是将来研究iPS细胞需要解决的主要问题。据此，在具体实践中提出以下优化方法：（1）转录因子及诱导策略的选择，以此既保证安全性，又提高诱导效率。A、小分子化合物诱导，在诱导过程中导入一些小分子化合物不但可以促进细胞重编程，甚至可以取代某些转录因子的作用。例如，最早发现的BIX-01294（组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂）可以取代Oct4。也有发现表明细胞内信号分子Wnt3a可以替代原癌基因c-Myc，并提高重编程效率。B、简化过程：有报道称，使用Ascl1、Brn2和Mytl1这3种因子可避开多能干细胞诱导步骤，在体外将MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）直接转变成有功能的神经元。简化诱导步骤使得安全性和诱导效率都得到了很大程度的提升。 C、蛋白质诱导多能干细胞，丁盛等( 2009) 报道，在细胞穿膜肽的协助下直接将转录因子编码的蛋白导入MEF，使其成为可长期自我更新的蛋白诱导多能干细胞(protein-inducedplu-ripotent stemcells，piPSCs) ，从而取代基因诱导，这种方法避免了遗传修饰，安全性高，被誉为干细胞领域的二次革命。但大大降低了iPS的生成率，技术上有待进一步改进。D、RNA诱导多能干细胞，近期有研究者在重编程过程中加入一些微小RNAs（miRNAs），发现这些小分子能取代一些重编程因子或提高重编程的效率和速度，可能产生更加安全的ips细胞。例如：Derrick等将4个关键蛋白质的mRNA导入人皮肤细胞，得到核糖核酸诱导多能干细胞，同时使细胞重新编程的速度提高了一倍，而效率是标准方法的100倍以上。（2）转运载体的选择，导入的外源因子包含肿瘤相关基因并不是威胁iPSCs安全性的唯一因素，协助转录因子转染所用的病毒载体也有诱发肿瘤的风险，为此，寻找更为安全的载体成为iPSCs研究的另一热点。A、病毒载体: 无论用逆转录病毒慢病毒还是腺病毒做载体均可能增加病毒感染细胞的风险，为此，Mostoslavsky等首次完成了仅用1个病毒载体同时表达4种转录因子，减少了细胞中病毒整合的位点，也降低了插入突变的概率。B、质粒载体: 为了摆脱病毒载体插入细胞基因组造成的风险，有人尝试使用更为安全的质粒载体。在2008年Yamanaka等用两个质粒反复感染MEF获得iPSCs其中一个为包含Oct4 Sox2 Klf4的cDNA序列; 另一个为c-Myc的cDNA序列，但由于此法需要质粒的多次反复感染，操作较为复杂，故未得到大范围应用。
3.iPS的应用
2.2 iPS在临床治疗中的可行性
iPS 细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离, iPS 细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。2007年12月, Hanna等用 iPS 细胞成功治疗了小鼠的镰状红细胞贫血症, 2009年初, Xu 等用从 iPS 细胞诱导来的内皮前体细胞和内皮细胞成功治疗血友病A，他们的研究虽然是在小鼠中进行的, 然而,这些成果验证了iPS细胞在基因治疗中的可行性, 从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定了基础。此外, iPS 细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现, iPS 细胞在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等,在临床疾病治疗中具有巨大的应用价值。
2.3 iPS为疾病研究提供体外模型
疾病特异性 iPS 细胞是研究疾病发生机理的重要工具，可以更好地研究疾病发病的机理、筛选和开发新的药物治疗方法。2008年 Dimos 等首次把来自于 80 多岁的肌萎缩侧索硬化症患者的皮肤细胞诱导为 iPS 并分化成运动神经元。Park 等将10种不同遗传病患者的细胞诱导为病人特异性的 iPS 细胞系。
2.4 iPS用于治疗罕见疾病
美国斯隆-凯特林研究所的 Lee 等研究人员首次用 iPS 细胞建立了家族性植物神经功能不全症(Familial dysautonomia, FD)的细胞模型。2012年，美国印第安纳大学报道，他们日前用人类诱导多能干细胞( iPSc) 疗法，成功治愈了一名回旋状脉络膜视网膜萎缩症患者。
2.5 iPS细胞应用于体细胞核移植技术
利用 iPS 细胞作为核供体细胞, 同适当的受体细胞融合后便可以直接获得转基因动物。这种将 iPS 细胞诱导技术同动物转基因技术相结合的方法，不仅可以提高动物的遗传本质, 而且可以打破物种的界限, 获得用传统的交配方法无法得到的动物新性状。
2.6 利用iPS技术培育转基因猪
利用iPS技术培育出一种准确的转基因猪, 改善它对某种疾病的耐性, 从而改善畜牧业。目前, 在牛、羊等其它大家畜中尚无这方面的报道, 如果我们能够建立这些动物的iPS细胞, 并应用其来生产基因打靶或转基因动物, 必然会提高转基因动物的效率,为转基因研究开创一片更加广阔的天地。
4.iPS的展望
随着研究的深入，以前被人们广泛认可的iPSC在移植免疫排斥伦理学方面的优势，以及与ESCs的相似性等问题都受到了质疑。最初人们赋予iPS极高的热情现如今已渐渐褪去，但iPS的研究不会因此而停下脚步。尽管迄今产生的iPS仍存在着一些问题，iPS在再生医学领域还是具有巨大的应用前景。为了使iPS安全地应用到临床，除了提高重编程效率，进行特定组织的高效定向诱导分化之外，未来对iPS的研究同时应关注与临床应用相关的问题。一旦实现可行、安全、高效、无病毒、无转基因的自体iPS细胞技术，必将给医学研究及多种疾病治疗带来深远的影响。
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