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		流式细胞仪检测细胞信号研究的几个优点

　　随着收集数据的能力，在单个细胞的水平，流式细胞仪检测细胞信号研究提供了几个优点流式细胞仪与裂解为基础的方法，有利于异构信号反应的检测和分析。因此，有可能区分一个强大的蛋白磷酸化响应于一个更小的，但更均匀的响应细胞与一小口。此外，特定的细胞表面标志物的复杂的细胞混合物，如全血细胞亚群内的荧光抗体，蛋白磷酸化介导的信号反应可以检测到。此外，罕见的细胞群无预富集的细胞可以被发现。其结果是，获得丰富的数据，从有限的细胞样品。

　　BD的?Phosflow产品包括一个系统优化的缓冲液和荧光单克隆抗体的流式细胞仪检测细胞内信号分子和特定的翻译后修饰。通过流式细胞术检测特定的磷酸化的抗原表位，细胞固定，并维持的信号??蛋白的磷酸化状态，然后透性，以允许进入细胞特异性结合靶蛋白的抗体。流式细胞仪分析染色的细胞，就可以捕获细胞内信号蛋白磷酸化的一个“快照”。

　　蛋白磷酸化是短暂的性质，严重受蛋白磷酸酶。适当的刺激时间点都需要及时灭活磷酸磷蛋白检测方法，包括Western blot分析。同样，流式细胞仪分析细胞样品必须被迅速固定保持phosphoepitopes。另一个重要因素是磷蛋白的表达水平。某些蛋白质的磷酸化事件可以是困难的，特别是当在单细胞水平检测细胞表达一个特定的信号蛋白的水平低，或表现出不完整的感兴趣的部位的磷酸化。BD提供高品质的明亮的荧光抗体直接结合，大大提高了细胞内磷酸化检测。

　　人类外周血单核细胞进行染色的Alexa Fluor?647抗人CD127的抗体在15分钟的刺激0 - 0.01，0.1-，1 - ，10 - ，或100-ng/mL重组人IL-2的剂量的。固定细胞，使用BD Cytofix固定缓冲液，使用BD Phosflow的烫发缓冲液III透性，并与荧光Stat5的（pY694）的特异性抗体，CD4，CD8，和CD25的染色。样品采集使用BD LSRFortessa?流式细胞仪系统，，并分析使用Cytobank软件。CD4 + T细胞亚群被确定，如图所示。相比其他T细胞，Stat5的磷酸化调节性T细胞在IL-2的浓度低得多。

　　多参数流式细胞仪检测细胞内信号的检测和分析复杂混合物中的细胞内和细胞亚群的关键优势。由于细胞信号转导研究往往未受刺激的刺激或抑??制分子，本文由中药标准对照品研究中心整理提供或未经处理的细胞治疗研究细胞反应往往提供的评估背景染色的最佳控制。与免疫球蛋白同种型对照，未刺激的细胞控制考虑到各抗体的独特的背景特征以及基底感兴趣的细胞内磷酸化蛋白的表达水平。细胞通透性需要暴露磷酸化的抗原表位。虽然多个缓冲系统，BD Phosflow的烫发缓冲III建议对于大多数应用程序。BD Biosciences公司的网站包含有用的信息，各种BD细胞表面标记和细胞内抗体在不同的缓冲条件和染色协议的性能。

　　BD Phosflow套件提供了有用的工具，用于分析的适应性和先天免疫系统的细胞所引起的信号反应。这些套件包括荧光抗体鸡尾酒特异的细胞表面标志确定具体的白细胞亚群以及荧光抗体主要磷酸化。此外，该套件提供兼容的缓冲区，阳性和阴性对照细胞，以及详细的协议。人单核细胞/ NK细胞的活化试剂盒（目录号562089）的BD Phosflow?允许同时研究从人全血中的B细胞，T细胞，单核细胞，NK细胞中的蛋白磷酸化，而的BD Phosflow?人T-细胞活化试剂盒（货号：560750）是有用的CD4与CD8 + T细胞中的磷酸化反应的研究。

　　人全血刺激的人IL-4和固定，透化，染色使用BD Phosflow人类单核细胞/ NK细胞激活工具箱。样品采集，并通过流式细胞仪使用的BD LSRFortessa?细胞分析仪，然后分析使用Cytobank软件的分析。白细胞的子集被确定，如图所示。STAT6的（pY641）和Stat5（pY694）磷酸化反应的的IL-4的分析结果显示，所有四个白细胞亚群通过磷酸化STAT6的IL-4。相比之下，Stat5的反应差别很大之间的细胞类型，不显示检测STAT5磷酸化响应与NK细胞。

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