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		实验大肠杆菌的对照培养分离及菌种保存方法

大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌属于细菌。它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。

一. 实验目的 : 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。

二. 实验原理 : 大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA，这是一种双链闭合环状的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常质粒DNA带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:

1．对抗生素的抗性 2．产生抗生素 3．降解有机复合物

4．产生大肠杆菌素 5．产生内毒素 6．产生限制修饰酶

pUC19质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。

三．实验材料 : 　E．coli InvaF' E．coli InvaF' (pUC19)

四．实验仪器、器皿及试剂:仪器 : 超净工作台恒温培养箱高压灭菌锅恒温水浴锅微波炉等。器皿: (见附录)

试剂 : 琼脂酵母抽提物胰蛋白胨 Nacl 氨苄青霉素 NaOH等

五．实验步骤 :

1. 配制培养基：

ａ．LB(Lurib-Bertani) media

酵母抽提物 (Yeast extract) 5g/L

胰蛋白胨 (trytone) 10g/L

Nacl 10g/L

加蒸馏水定容至1000ml调节pH值至7.0。配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中，按15 g/L加入琼脂加热至充分熔化，即成固体培养基。ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH2 O至100ml。将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min

2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入Amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。3. 待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种 :E.coli InvaF' 和 E.coli InvaF' (pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:

第一次划线后接种环灼烧第二次划线起点与第一次　　如此在平板上

再进行第二次划线　划线交*，接种环灼烧后再

进行第三次划线

4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。5. 比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coli InvaF' E.coli InvaF' (pUC19)的单菌落分别接种至含Amp和不含Amp的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。6. 分别吸取0．5 ml菌液在无菌条件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的冻干管中，混匀至-20℃保存。

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